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猪繁殖与呼吸综合征诊断技术的研究进展

http://www.zhujiage.com.cn 猪价格网 2017-07-26 08:14 右右 网友评论 |

  猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以感染妊娠晚期流产、产死胎、早产、木乃伊胎和弱胎,各种年龄猪(特别是)呼吸障碍、厌食为特征的高度传染性疾病,在美国最早发生该病。荷兰人Wensvoot等1991年首次于发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时被称为Lelystad病毒。随后很多国家也相继分离到此病毒。郭宝清等(1996)首次从国内有相似症状发病猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒,从此代表该病在我国的存在。杨汉春阐述PRRSV有2个血清型,即美洲型(代表毒株为VR-2332株)和欧洲型(代表毒株为LV株),欧洲和美洲分离株毒株之间存在明显的抗原差异性。在对我国分离毒株的基因组进行分析表明,目前在我国流行的毒株均属于美洲型,并没有发现和分离到欧洲型毒株。汤德元等分析了美洲型的PRRSV,其可分为4个亚群,我国现今流行的PRRSV毒株属于四个亚群中的3个亚群,即以PRRSV BJ-4株为代表的属于1亚群;以HB-1(sh)/2002、CH-la和HB-2(sh)/2002株为代表的属于2亚群;以BJ-13为代表的属于4亚群。本病传播迅速,尤其在进步和经济发达国家,由于猪群密集、流转频繁,更易引起流行。目前,各国对本病进行了大量深入的研究。PRRS可危害各种日龄阶段的猪,并且临床表现多样,同时引起细菌病或病毒病等继发感染,导致临床症状的复杂化。因此,仅根据临诊症状及流行病学特点很难做出诊断,此病的诊断必须借助于实验室诊断技术。本文主要对近年来实验室对猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的进展进行综述,以期为猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供一定的理论支持和参考。1 病毒的分离鉴定

  病毒的分离鉴定是目前病毒病最真实的一种诊断方法。常用于PRRSV分离的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞(PAMS)、非洲绿猴肾细胞(MA-104、CL-2621、Marc-145等),以及克隆自Marc-145的更敏感的HS.2H细胞。但分离PRRSV欧洲株只能用PAM细胞。该病毒的分离可来源于血清、肺脏、肺泡灌出物、脾脏、淋巴结和扁桃体,尤其以血清和肺脏组织分离成功率最高;较易从急性感染病例猪中分离到PRRSV;据有关报道PRRSV在死胎和新生仔猪中分布情况不一致,流产在死胎脾脏和淋巴结巨噬细胞分布含量比较多,而新生仔猪则常见于肺脏。采集后的样品应冷藏或冷冻运输和保存,将采集的样品经过处理后接种于长满的单层PAMs细胞后1~4 d即可出现细胞病变(CPE),细胞最初呈现灶状变圆、膨大,随后皱缩,脱落形成拉网空洞。当接种于CL-2621细胞时,CPE出现得比较缓慢,需在感染后2~6 d才会侵染细胞单层。PRRSV在接种于Marc-145细胞48 h即可出现典型的CPE变化,具高度敏感性。由于致病力的不同,不同分离株在细胞培养上生长情况各异,甚至有些病毒株并不出现CPE现象,与此同时,必须同时结合间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)等病原检测方法进行验证。

  2 血清学诊断方法

  血清学试验是一种相对较于传统的PRRSV诊断方法,在病毒抗原和抗体的检测用得比较广泛。血清学实验有其较强的特异性,但在敏感性上有所欠缺。

  2.1 中和试验

  在对PRRSV抗体进行检测的过程,中和试验(SN)对PRRSV的抗体特异性是很好的,但是由于中和抗体出现的时期比较晚,需在感染后4~5周才能首次检测到VN抗体,感染后的10周达到最高,在大部分的临床检测PRRSV新近病例中,与IPMA、IFA、ELISA作比较其敏感都低于它们,所以SN不适用于对PRRSV感染的早期诊断。Yoon等对中和试验进行了改良,其改良内容是加入20%的猪新鲜血清增加补体的量,目的是为了提高检测敏感性,在感染后9~11d即可检出较高滴度的VN抗体。但该方法也对环境、人员的技术要求高,目前也大多局限在实验室做研究用。

  2.2 酶联免疫吸附试验

  Albina等将PRRSV接种在PAM细胞上,以制备阳性抗原和模拟抗原,首次建立了检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),许多结果表明ELISA具有与IPMA一样的特异性,并且敏感性更高,如今商品化的间接ELISA诊断试剂已在全球范围内广泛使用。罗长保等将ATCCVR-2332株接种Hs.2H细胞,制备抗原,以血清抗体与模拟抗原反应的d450nm值作为标准,从而建立了用于血清中PRRSV抗体的间接ELISA方法,实验结果显示,有着与IFA相同的特异性,更高敏感性。王刚等用差速离心法提纯抗原,以NC膜做载体,成功地建立了Dot-ELISA,并与IFA具有相同的特异性,敏感性高于IFA。仝利剑等建立抗体双抗原夹心ELISA方法,利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对该方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区多个养的近300份血清,总体的特异性和敏感性都较高。就目前看来,ELISA方法快速灵敏,特异性和敏感度均较高,操作简便,结果能自动显示,对于大批量血清样品的检测也实用。

  2.3 间接荧光抗体试验

  间接荧光抗体试验与免疫过氧化物酶单层试验具有一样的特异、敏感性,如今在欧洲和北美的许多国家得到了普遍的使用。在我国也有自己生产的IFA和微量IFA诊断试剂盒供应。可以从感染6d后的猪体内检测到PRRSV抗体,在30~50d时抗体达到峰值,随后逐渐降低,直至4~6个月后抗体消失,但该方法需要进行细胞培养,需用倒置显微镜观察,结果不能自动显示,对所需环境和人员的要求高,不适合大规模监测;并且,IFA与IPMA只能检测出与实验用PRRSV抗原性相近的PRRSV分离株。

  2.4 免疫过氧化物酶单层试验

  免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)方法是历史最长的检测PRRSV抗体的方法,在欧洲国家被普遍使用,IPMA具有较高的敏感性和特异性,能在病毒感染6 d后猪体中检出PRRSV抗体,该方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等细胞系上进行完成的,不好的是由于母猪血清和4周龄内的仔猪血清可以与对照的巨噬细胞反应,导致背景着色,从而影响结果的判定,且结果不能自动显示,具一定的主观性;同时还需细胞培养和倒置显微镜观察,费力费时,大规模检测费高,也不利于推广应用。

  2.5 乳胶凝集试验(LAT)

  王忠田等利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原,成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测,具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测,结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%,与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87%,检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层检测PRRSV血清抗体的新方法。

  2.6 胶体金抗体检测技术

  崔尚金等建立猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术,运用胶体金标记纯化后的PRRSV基因工程表达抗原,以一种微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法(GICA)。特异性交叉试验证明,GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性,与其他方法对比检测证实了其敏感性,生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性。猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测PRRSV抗体提供了一种快速简便的方法。当然,目前国内一些大专院校也建立了更为方便、快速的诊断方法,如乳胶凝集试验和间接血凝试验,但其在敏感性、特异性和试剂的重复性、稳定性上均有待提高。

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